产品简介

HRP标记试剂盒采用高碘酸钠氧化法活化辣根过氧化物酶（HRP）的糖基，经过氧化以后活化的HRP 带有醛基可以与待标记物的游离氨基结合，发生希夫碱反应（Schiff's Base Reaction）。

HRP标记试剂盒使用方法：

1.准备标记物：首先去除待标记物（蛋白或者抗体）中的叠氮钠、甘油、氨基物质（包括甘氨的酸、Tris等）、EDTA等物质。可采用透析或超滤的方法置换缓冲液，以除去以上物质，以达到优良标记效果。透析缓冲液0.01M CB,PH:9.6 缓冲液(说明书附件有经验配方无需调整PH），若实验室没有碳酸盐试剂再采用0.01M PBS（PH:7.0-7.4均可）透析或超滤置换缓冲液，最后将抗体/蛋白调整到浓度2mg/ml；如果抗体和蛋白不含上述这些干扰物质可以直接用上述PBS或CB缓冲液调整浓度到2mg/ml备用。对于小分子物质不建议直接标记HRP，若仍需标记，需要自行摸索浓度，保证HRP的比例过量，如果不能确保HRP过量，标记完之后最好透析或过滤除去未标记的小分子物质。

2.以下以标记1mg抗体（2mg/ml）为例详细说明实验流程：

实验前准备

   从4℃中取出HRP标记试剂盒，各组分使用前混匀。

标记反应

待标记抗体 500µl（1mg，2mg/ml），加入预活化HRP（100ul，1mg，抗体:HRP标记质量比按照 1：1) 用移液器反复吹打几次以充分混匀，混匀后加入HRP标记启动液108ul，（加入启动液量比例：每10ul（抗体和HRP混合液）加1.8ul启动液）继续混匀数次，避免产生气泡。然后避光30℃-37℃温箱偶联反应2-3小时，若遇快要下班也可放4℃反应24小时左右（此法效果一样或者更好不必担心）。

标记反应终止

单支标记终止液（冻干粉）中加入1ml去离子水配成标记终止液，取50ul加入步骤2所述反应液中（加入标记终止液量比例：每1mg HRP加入终止液50ul），充分混匀，室温放置1小时或者4℃ 2小时。（注：标记终止液不稳定，不能保存，必须现配现用）

标记物产物收集与保存

终止完成后，加入等体积的标记物保存液，充分混匀，置于-20℃可以保存一年。如果想更长期的保存建议先用0.067M PBS  PH:7.0（说明书附件有经验配方）透析或超滤置换缓冲液后再加标记物保存液。这样可以保存3年左右甚至更长。

反应体系摘要：

溶液名称：待标记抗体+活化HRP+标记启动液+标记终止液+保存液

溶液体积：  500µl   +  100µl  +    108µl   +  50µl    + 758µl =1516µl

注意事项：

待标记物缓冲液成分过于复杂以及含有氨基小分子和NAN3的初始缓冲液必须透析或超滤置换掉，请采用0.01M PBS（PH:7.0-7.4均可）或0.01M CB，PH:9.6缓冲液均可。

如果待标记物不是抗体是其它蛋白，那么请根据分子量参考蛋白和酶用量：若分子量在40KD以上建议1mg蛋白使用1mg HRP；如果分子量在30KD左右，建议1mg蛋白使用1.3mg HRP；如果分子量在20KD左右，建议1mg蛋白使用2mg HRP；如果分子量在10KD左右，建议1mg蛋白使用4mg HRP；此时启动液和终止液请按步骤2和3描述标准适量加入；如果标记量为小于1mg的抗体或蛋白（最小可以0.1mg），HRP和其它试剂加入量按比例折算即可。

小分子药物不建议直接标记HRP，因为HRP的结构不能结合足够的药物会造成效价偏低，这种情况建议先偶联BSA增加小分子偶联量再进行HRP标记，这样效果会非常好。

如果待标记物含有其它蛋白需要把无关蛋白同样计算进去，尽快如此也请您慎重选择这样的样品进行标记。

本试剂盒保存4℃可以保证1年内开启有效，活化HRP开启后小心取用切勿污染碱性物质。

终止液干粉5000ug规格5支/1000ug规格2支，原则上每一支配好后仅限一次性使用，因此您可以根据您的实验总量合理配制使用。